ICS65.020 B20 团体标准 T/AFFI039-2023 鲜葡萄及葡萄干中黑曲霉的测定 2023-04-11发布 2023-04-11实施 阿拉尔果业行业联合协会发布 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 目录 前言.....................................................1 1范围..................................................2 2规范性引用文件........................................2 3术语和定义............................................2 4原理..................................................2 5培养基与试剂..........................................2 6标准菌株..............................................3 7仪器和设备............................................3 8检测程序..............................................3 9生化实验..............................................4 10菌落计数.............................................4 11结果与报告...........................................5 11.2报告...............................................5 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 1前言 本文件按照GB/4789.15《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》的规定起草。 本文件由新疆兵团第一师阿拉尔市果业行业联合协会提出。 本文件由新疆兵团第一师阿拉尔市果业行业联合协会归口。 本文件起草单位：新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院、新疆维吾尔自治区标准 化研究院、新疆天科博创科技有限公司、新疆兵团第一师阿拉尔市果业行业联合协会、新 疆艾旗斯德检测科技有限公司 本文件主要起草人：孙蕾、范田丽、祁来芳、文红梅、丁煜玮、付晓静、周皓、廖毅凡、 何军、陈晨 本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院（乌鲁木 齐市河北东路188号）。 新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院：联系电话：0991-3191180；邮编：830011 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 2鲜葡萄及葡萄干中黑曲霉的测定 1范围 本标准适用于葡萄中黑曲霉的测定。 本标准规定了葡萄中黑曲霉的检验方法。 本文件适用于新疆地区鲜葡萄、葡萄干中黑曲霉的检测。 2规范性引用文件 本文件中引用的文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注 日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T6682分析实验室用规定的一级水。 3术语和定义 3.1鲜葡萄freshgrapes 选用新鲜、洁净，经过一定加工或保鲜处理的葡萄。 3.2葡萄干Raisins 经自然风干或人工加热等方式使葡萄果实脱水而成。 3.3黑曲霉Aspergillusniger 黑曲霉属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属真菌中的常见种。在高温、 高湿环境下易大量生长繁殖，多生于多汁的果实上，引起腐烂变质。 4原理 被感染葡萄中的黑曲霉可在马铃薯葡萄糖琼脂上于28℃条件下培养5d，检测霉菌，从 中分离黑曲霉，通过生化鉴定确定黑曲霉菌并计数，算出每毫升检验中黑曲霉菌数。 5培养基与试剂 5.1培养基 5.1.1马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）。 5.1.22%淀粉查氏培养基。 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 35.2试剂 5.2.1无菌生理盐水。 5.2.2I2-Ki试剂(花粉活力染色液)。 6标准菌株 6.1黑曲霉标准菌株 7仪器和设备 7.1培养箱：28℃士1℃。 7.2拍击式均质器及均质袋。电子天平：感量0.1g。 7.3无菌锥形瓶：容量500mL。 7.4无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。 7.5无菌试管：18mmx180mm。 7.6旋涡混合器。 7.7无菌平皿:直径90mm。 7.8恒温水浴箱:46℃士1℃。 7.9显微镜：10倍~100倍。 7.10微量移液器及枪头：1.0mL。 7.11郝氏计测玻片：具有标准计测室的特制玻片。盖玻片。 7.12测微器:具标准刻度的玻片。 7.13电子天平：感量0.01g。 7.14振荡器 8检测程序 见图1。 检样 25g样品+225mL无菌稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2-3个适宜稀释度的样品匀液，每个平皿加入1mL，每个稀释度做两个平行 每皿中加入20mL~25mL马铃薯葡萄糖琼脂 菌落计数28℃±1℃ 5d 报告 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 4图1黑曲霉菌数测定检验程序 8.1检测步骤： 8.1.1称取25g样品置盛有225mL生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1min～ 2min，制成1:10的样品匀液。 8.1.2取1mL1:10样品匀液注入含有9mL无菌稀释液的试管中，另换一支1mL无菌吸管 反复吹吸，或在旋涡混合器上混匀，此液为1∶100的样品匀液。 8.1.3按5.1.3操作，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL 无菌吸管。 8.1.4根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递 增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。同时分别取1mI无 菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。 8.1.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯葡萄糖琼脂(可放置干46℃±1℃恒温水浴 箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。置水平台面待培养基完全凝固。 8.2培养 琼脂凝固后，正置平板，置28℃+1℃培养箱中培养,观察并记录培养至第5d的结果。 （注：若污染程度过高，可在第3d开始进行观察。） 9生化实验 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落进行鉴定试验。 9.1黑曲霉菌落形态观察 黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝为白色，之后变成鲜黄色直至黑色厚绒状， 背面无色或中央略带黄褐色，顶部形成球形顶囊。其分生孢子头球形，直径700～800μm， 褐黑色。 9.2淀粉分解实验 淀粉分解实验：用2%淀粉查氏培养基进行。用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子一环于装 有100mL无菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中，振荡。取1mL孢子悬液注入2%淀粉查氏培 养基平板中涂布，37°C倒置培养2天，向培养基中滴入I2-Ki试剂(花粉活力染色液)，用 直尺测量菌落产生的透明圈大小并记录。 9.3产柠檬酸鉴定 用无菌接种环轻轻刮下典型或可疑菌的菌丝及孢子于无菌水中制成菌悬液，装在有 PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基的锥形瓶中摇匀。置于振荡器中，35°C，200r/min培养 2天。取5mL发酵液于试管中，滴入饱和CaCO3溶液，有白色沉淀则证明产生柠檬酸,黑曲 霉产生柠檬酸。 10菌落计数 依据GB4789.15-2016食品安全国家标准霉菌和酵母计数，选择有典型的黑曲霉菌菌 落的平板，以菌落单位（colony-formingunits，CFU）表示。选取菌落在10CFU～150CFU 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 5的平板，根据菌落形态计数黑曲霉，蔓延生长覆盖整个平板的可记录为菌落蔓延。 11结果与报告 11.1结果 11.1.1计算同一稀释度的两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数。 11.1.2若有两个稀释度平板上菌落数均在10CFU～150CFU之间，则按照GB4789.2的相应 规定进行计算。 11.1.3若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可 记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 11.1.4若所有平板上菌落数均小干10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数 计算。 11.1.5若所有稀释度的平板菌落数均不在10CFU～150CFU之间，其中一部分小干10CFU 或大干150CFU时，则以最接近10CFU或150CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 11.2报告 11.2.1菌落数按“四舍五入”原则修约。菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告；菌 落数在10～100之间时，采用两位有效数字报告。 11.2.2菌落数大于或等于100时，前第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数 字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按"四舍五人"原 则修约，采用两位有效数字。 11.2.3若空白对照平板上有菌落出现，则此次检测结果无效。 11.2.4称重取样以CFU/g为单位报告。 全国团体标准信息平台 T/AFFI039—2023 6团体标准《鲜葡萄及葡萄干中黑曲霉的测定》编制说明 标准名称鲜葡萄及葡萄干中黑 曲霉的测定标准主要起草人孙蕾、范田丽、祁来芳、文 红梅、丁煜玮、付晓静、周 皓、廖毅凡、何军、